SECUENCIACIÓN DE VSR

Secuenciación directa de los productos amplificados

La secuencia de nucleótidos de los segmentos amplificados, nos permite determinar las características del virus detectado, y su tipificación. La secuenciación nucleotídica del gen de la proteína G, mostró variabilidad aminoacídica en los subgrupos A y B.(1)

La proteína G es utilizada para la tipificacion del virus, ya que sus diferentes secuencias dan lugar a 6 subgrupos del VSR tipo A y 3 subgrupos al tipo B. (2)

Referencias Bibliográficas:

1. Grijalva M. Identificación y genotpificación de VSRH mediante RT_PCR, en Qutio-Ecuador.  [Internet]. 2012. [citado 26  julio 2020]. Disponible  en: https://repositorio.espe.edu.ec/bitstream/21000/5897/1/T-ESPE-034431.pdf

2. WIPO. PCTMétodo de detección del virus sincitial respiratorio humano tipo A, del virus sincitial respiratorio humano tipo B y del metapneumovirus humano. [Internet]. 2016. [citado 26  julio 2020]. Disponible  en:  https://patentimages.storage.googleapis.com/fc/5c/68/9db3b3890e97e3/WO2016066878A1.pdf

Imágenes tomadas de: https://patentimages.storage.googleapis.com/fc/5c/68/9db3b3890e97e3/WO2016066878A1.pdf

PCR PARA NEUMONÍA POR VSR

PCR PARA DIAGNOSTICAR VSR
TEMA	Detección Y Tipificación Del Virus Sincitial Respiratorio Mediante La Técnica RT- PCR Anidada En Pacientes Con Infección Respiratoria Aguda
OBJETIVO	Desarrollo de un protocolo de RT-PCR anidada para la detección y tipificación del VSR en muestras respiratorias de niños con síntomas compatibles con IRA.
MUESTRA	Muestras respiratorias: Hisopados o aspirados faríngeos o nasofaríngeos
TIPO DE ÁCIDO NUCLEICO	ARN viral
GEN	Gen de la nucleocápside
SECUENCIA A AMPLIFICAR	Región comprendida entre los genes de nucleoproteína y la proteína fosforilada. AMPLICONES: 334 pb (Tipo A), y 183 pb (Tipo B).
PCR	PCR de transcripción reversa (RT-PCR)] con el QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen) Dos iniciadores más una mezcla de transcriptasa reversa SuperScript II y Taq DNA polimerasa Platinum del kit SuperScript One-Step RT-PCR UIT Platinum Taq (Invitrogen)
VISUALIZACIÓN	Electroforesis en gel de agarosa al 2.0%; a 100 V durante 50 min. Detección y Tipificación del VSR por RT-PCR:Pozo 1: control (-). Pozo 2: muestra 2 (c). Pozo 3: muestra 2 (s). Pozo 4: muestra 5 (c). Pozo 5: muestra 5 (s). Pozo 6: muestra 16 (c). Pozo 7: muestra 16 (s). Pozo 8: marcador de peso molecular. Pozo 9: muestra 17 (c). Pozo 10: muestra 17 (s). Pozo 11: muestra 18 (c). Pozo 12: muestra 18 (s). Pozo 13: muestra 19 (c). Pozo 14: muestra 19 (s). (c): MgCl2 ; (s): MgSO4. Se indican los tamaños moleculares aproximados de las bandas.
SENSIBILIDAD  20pgADN/ml  (73%) ; ESPECIFICIDAD cercana a 99%
DETECCIÓN	RT-PCR Cebadores: RSVAB F (5´-GTCTTACAGCCGTGATTAGG-3´) y RSVAB R (5´-GGGCTT-TCTTTGGTTACTTC3´)
TIPIFICACIÓN	PCR anidada VSR tipo A: iniciador RSVA F (5´-GATGTTACGGTG-GGGAGTCT-3´) y RSVA R (5´- GTACACTGTAGTTAATCACA-3´) VSR Tipo B: iniciador, RSVB F (5´-AATGCTAAGATGGGGAGTTC-3´) y RSVB R (5´-GAAATTGAGTTAATGACAGC-3´)

Referencia Bibliográfica
Mojica M, Escobar M, Escalante M, Jaramillo C, Delgado M.  Detección y tipificación del virus sincitial respiratorio mediante la técnica RT- PCR anidada en pacientes con infección respiratoria aguda.[Internet]. 2009. [citado 19  julio 2020]. Disponible en: https://www.medigraphic.com/pdfs/iner/in-2008/in082c.pdf