TÉCNICAS DE EDICIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS EN VSR

 

TEMA:	La infección por el virus respiratorio sincitial en ratas Fischer 344 se atenúa mediante un ARN de interferencia corto contra el gen RSV-NS1
TIPO DE EDICIÓN:	In vivo, Somático
DIRIGIDO HACIA:	gen NS1
DIRIGIDO POR:	siRNA + siNS1 (anti-RSV)
VECTORES:	Plásmido de quitosano
ÓRGANO A TRATAR:	Mucosa pulmonar (células epiteliales pulmonares)
VÍA DE ADMINISTRACIÓN:	Vía intranasal
RESULTADOS:	Corto plazo:  redujo significativamente los títulos de RSV y la hiperreactividad de las vías respiratorias Mediano plazo:  evitar el daño pulmonar Largo plazo: profilaxis para prevenir la infección por VSR y reducir sus complicaciones.

Referencia bibliográfica:

1. Kong, X., Zhang, W., Lockey, R. F., Auais, A., Piedimonte, G., & Mohapatra, S. S. Genetic Vaccines and Therapy. Respiratory syncytial virus infection in Fischer 344 rats is attenuated by short interfering RNA against the RSV-NS1 gene. [Internet].  2007. [citado 30 agosto 2020]. Disponible  en: https://doi.org/10.1186/1479-0556-5-4

Terapia con Stem Cells

Tipo de Stem Cell

células madre mesenquimal de médula ósea (MSC), células madre embrionarias pluripotenciales (ESC) y células madre pluripotentes inducibles (iPSC)

Método de obtención:

• ESC:se aíslan de la masa celular interna de los blastocistos preimplantatorios de un embrión de mamífero temprano, y se las mantiene en cultivo in vitro.
• iPSC: se generan clásicamente reprogramando fibroblastos por transducción retroviral de los factores de transcripción Klf4, Sox2, Oct4 y c-Myc.
• MSC: se aíslan de la médula ósea, y se las reprograma en células madre mesenquimales para posterior mente transformarlas en células progenitoras pulmonares.

Vía de administración:

Injerto específicos del sitio en los tejidos lesionados 

Resultados

Corto plazo: regenerar, reparar y reconstituir los tejidos pulmonares

Medio: favorecer el proceso de alveologénesis, y desarrollar estrategias terapéuticas para combatir enfermedades pulmonares

Largo: reducir el trasplante de pulmón dependiente del donante

Referencia bibliográfica:

1. Akram K, Patel N, Spiteri M, Forsyth N. Regeneración pulmonar: enfoques terapéuticos mediados por células madre endógenas y exógenas. [Internet].  2016. [citado 23 agosto 2020]. Disponible  en:

https://www.mdpi.com/1422-0067/17/1/128/htm

ADN RECOMBINANTE

 ADN RECOMBINANTE EN LA NATURALEZA

El ADN se recombina de forma natural en procesos como la reproducción sexual, la transformación bacteriana y la infección viral. (1)

En la transformación bacteriana, se da una transferencia horizontal de genes donde una bacteria toma ADN libre del ambiente y lo incorpora a su genoma. (1)

ADN RECOMBINANTE EN NEUMONÍA POR VSR

Se busca conseguir la inmunidad de las celulas T portectoras contra el VSR mediante BCG (bacilo Calmette Guérin de Mycobacterium bovis ) recombinante, con el objetivo de reducir la gravedad de la enfermedad y de sus síntomas y en base a este estudio promover el diseño de una vacuna.  Los genes a clonar son los que codifican las proteínas RSV-N y RSV-M2, utilizando el plásmido integrador pMV361 como vector, para producir las cepas BCG-N y BCG-M2 recombinantes, las cuales seran utilizadas como vacunas . La expresión de proteínas de RSV recombinantes se evaluó mediante análisis de transferencia Western. (2)

EJEMPLO DE TRANSGÉNICO ANIMAL

Rana translucida: En Japón, Hiroshima, en 2007 crearon unas ranas translucidas, cruzando genes de 2 especies de ranas japonesas. Con el objetivo de poder de estudiar el efecto de químicos en sus órganos, el desarrollo del cáncer, etc. en estos animales. La justificación de la creación de esta especie transparente de ranas, es que evitara hacer las vivisecciones para saber cómo funcionan sus órganos, ya que éstos se distinguen claramente a través de la piel. (3)

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1.Audesirk T  , Audesirk G, Byers B. Biología: la vida en la tierra.  [Internet]. 2011 . [citado 16 agosto 2020]. Disponible  en: https://books.google.com.ec/books?id=uO48-6v7GcoC&pg=PA244&lpg=PA244&dq=ADN+recombinante+en+las+bacterias+de+forma+natural&source=bl&ots=vVqCJPZHRA&sig=WBu36UFESD1uPjQoLyfFckTUlvI&hl=es&sa=X&ei=Ol_BUO3RMI6-9QTI-YCoBw#v=onepage&q=ADN%20recombinante%20en%20las%20bacterias%20de%20forma%20natural&f=false

2.Bueno S, González P, Cautivo K, Mora J. Protective T cell immunity against respiratory syncytial virus is efficiently induced by recombinant BCG .  [Internet]. 2008 . [citado 16 agosto 2020]. Disponible  en: https://www.pnas.org/content/105/52/20822

3. CIGET. Animal Transgénico.  [Internet]. S/f . [citado 16 agosto 2020]. Disponible  en: https://www.ecured.cu/Animal_transg%C3%A9nico#Primeros_experimentos

TÉCNICA MOLECULAR EPIGENÓMICA EN NEUMONÍA POR VSR- Secuenciación y qRT-PCR de miARN

 Tema: Identificación de la diafonía de miARN-ARNm en la neumonía pediátrica asociada al virus respiratorio sincitial (RSV-) a través del análisis integrado de miARNoma y transcriptoma

Objetivo: identificar los biomarcadores potenciales e investigar los mecanismos moleculares de la neumonía pediátrica asociada al VSR grave.

Muestra: de sangre completa con EDTA de niños con infección por RSV (La infección por VRS se diagnosticó por: RT-PCR en hisopos nasofaríngeos)

Métodos:

1. Extracción de ARN de muestras de sangre total utilizando el reactivo TRIzol.  
2.  Los ARN totales extraídos se utilizaron para la secuenciación de alto rendimiento de miARN y ARNm. (Las bibliotecas de ARNm se construyeron utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext Ultra para Illumina)  
3. PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). -sistema de detección de PCR en tiempo real Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad) usando SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa) con cebadores específicos
• Usaron secuencias de cebadores para la transcripción inversa específicos para miARN 
• Usaron Cebadores específicos para qPCR.
4. Análisis de los datos con los paquetes de software miRanda y RNAhybrid.

Resultados:

ü Pico de miARN aparente alrededor de 20-24 nt
ü  168 miARN exclusivamente en niños con neumonía grave asociada al RSV
ü  131 miRNA exclusivamente en aquellos con neumonía leve asociada al RSV 
ü  miARN regulados positivamente en niños con neumonía grave asociada al VSR fueron hsa-miR-1271-5p, hsa-miR-10a-3p, hsa-miR-125b-5p y hsa-miR-30b-3p.

Referencia Bibliográfica

 1.Zhang, X., Huang, F., Yang, D., Peng, T., & Lu, G. Identification of miRNA-mRNA Crosstalk in Respiratory Syncytial Virus- (RSV-) Associated Pediatric Pneumonia through Integrated miRNAome and Transcriptome Analysis. Mediators of Inflammation.  [Internet]. 2020. [citado 9  agosto 2020]. Disponible  en: https://www.hindawi.com/journals/mi/2020/8919534/

PRUEBA DE TAMIZAJE Y CONFIRMATORIA PARA NEUMONÍA POR VSR

PRUEBA DE TAMIZAJE

Dentro de las pruebas de tamizaje encontramos los Test rápidos (RADTs Rapid antigen detection test), que detectan antígenos virales en menos de 30 minutos, y son de fácil acceso (baratos). Además se los utiliza cuando el virus está circulando en la comunidad y con esto descartar contagios y prevenirlos. Existen 3 tipos: inmunocromatografía (ICR),  enzimoinmunoanálisis (EIA),  inmunoanálisis óptico (OIA). (1)

PRUEBAS CONFIRMATORIAS

Se utilizan para un diagnostico definitivo: (2)

-Detección de antígenos virales por IFI o por ELISA 

-Da detección de ácidos nucleicos por ensayos como la RT-PCR 

-Aislamiento viral en cultivo celular de esputo.(importancia filogénica)

    

  Detección de ARN viral del VSR por RT-PCR              C. Control positivo de la Inmunofluorescencia para VSR

REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA

1. Alfayate S, Bengoa A, Cocho P.Grupo de Patología Infecciosa AEPap. Test de detección rápida del virus sincitial respiratorio .[Internet]. 2014. [citado 1 agosto 2020]. Disponible  en:

https://www.aepap.org/sites/default/files/test_de_deteccion_rapida_de_virus_respiratorio_sincitial.pdf

2.A. Hogan, C., Caya, C., & Papenburg, J. Rapid and simple molecular tests for the detection of respiratory syncytial virus: a review. Expert Review of Molecular Diagnostics, [Internet]. 2018. [citado 1  agosto 2020]. Disponible  en: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29890085/

IMÁGENES TOMADAS DE: https://pdfs.semanticscholar.org/984c/34d36fbe5431071f5e7e0bae9142fe22b635.pdf